Jak działa chromatografia cieczowa – rola fazy ruchomej i mechanizm rozdziału analitów

Zarówno HPLC, jak i LC-MS opierają się na tej samej zasadzie fizykochemicznej, polegającej na różnicach oddziaływań analitów z fazą stacjonarną oraz fazą ruchomą. Podczas przepływu próbki przez kolumnę chromatograficzną poszczególne składniki mieszaniny oddziałują z fazą stacjonarną w różnym stopniu, co prowadzi do ich rozdziału w czasie retencji^[2]. W klasycznej chromatografii cieczowej szczególną rolę odgrywa faza ruchoma HPLC, której skład i czystość mają strategiczny wpływ na jakość rozdziału chromatograficznego. Nowoczesne systemy chromatograficzne mogą być wyposażone w różne typy detektorów, w tym UV-Vis, fluorescencyjne oraz spektrometry mas, co znacząco rozszerza możliwości analityczne tych metod^[3].

HPLC vs LCMS – podstawowe różnice w detekcji i możliwościach analitycznych

Podstawowa różnica w porównaniu HPLC vs LC/MS dotyczy sposobu detekcji analitów. W systemach HPLC detekcja najczęściej opiera się na pomiarze absorbancji promieniowania UV lub UV-Vis. Metoda ta umożliwia ilościowe oznaczanie związków chemicznych pod warunkiem, że wykazują one odpowiednie właściwości spektroskopowe. Z tego względu chromatografia HPLC jest szeroko stosowana w rutynowej analizie farmaceutycznej, gdzie wykorzystuje się ją do oznaczania substancji czynnych, produktów degradacji oraz zanieczyszczeń w preparatach leczniczych^[4].Technika LC-MS stanowi rozwinięcie chromatografii cieczowej poprzez sprzężenie jej ze spektrometrią mas. W takim układzie chromatografia odpowiada za rozdział składników próbki, natomiast spektrometr mas umożliwia ich identyfikację na podstawie stosunku masy do ładunku (m/z). Dzięki temu możliwe jest jednoczesne oznaczanie wielu związków chemicznych nawet w bardzo złożonych matrycach biologicznych lub środowiskowych. W analizach porównujących HPLC vs LC/MS podkreśla się, że spektrometria mas charakteryzuje się znacznie wyższą czułością oraz selektywnością^[5].

Badania porównawcze różnych platform LC-MS wskazują, że spektrometria mas pozwala na oznaczanie bardzo niskich stężeń analitów oraz na rozróżnianie związków o bardzo zbliżonej masie cząsteczkowej. Szczególnie wysoką selektywność zapewniają wysokorozdzielcze spektrometry mas (HRMS), które umożliwiają odróżnienie pików o różnicy masy rzędu setnych części daltona. Zdolność ta znacząco zwiększa możliwości identyfikacji związków chemicznych w analizach środowiskowych i biomedycznych^[6].

Kiedy wybrać HPLC, a kiedy LCMS – praktyczne zastosowania w analizie laboratoryjnej

W praktyce laboratoryjnej wybór pomiędzy HPLC a LC-MS zależy przede wszystkim od charakteru analizowanej próbki oraz wymaganej czułości metody. HPLC jest szczególnie przydatna w rutynowej analizie ilościowej, na przykład w kontroli jakości leków czy badaniu czystości związków chemicznych. Natomiast LC-MS znajduje szerokie zastosowanie w analizie próbek biologicznych, środowiskowych i żywnościowych, gdzie konieczne jest oznaczanie śladowych ilości związków chemicznych w obecności licznych interferentów^[7].

Jak jakość rozpuszczalników wpływa na wyniki – znaczenie LC-MS solvent quality w analizie

Jednym z czynników wpływających na jakość wyników analizy chromatograficznej jest czystość stosowanych rozpuszczalników. W analizach LC/MS wymagania dotyczące LC/MS solvent quality są znacznie bardziej rygorystyczne niż w klasycznej chromatografii HPLC. Nawet śladowe zanieczyszczenia obecne w rozpuszczalnikach LC-MS lub dodatkach fazy ruchomej mogą powodować powstawanie tła sygnału, aduktów jonowych oraz zjawiska supresji jonizacji. W konsekwencji może dochodzić do zwiększenia szumu tła, pojawiania się tzw. „ghost peaks” w chromatogramie oraz obniżenia czułości detekcji (ryc.1)^[8].

Zaznaczony sygnał oznacza artefakt chromatograficzny, który nie reprezentuje rzeczywistego analitu w próbce, lecz pochodzi z zanieczyszczeń systemu chromatograficznego lub fazy ruchomej.

Ponadto zanieczyszczenia mogą kumulować się na powierzchni fazy stacjonarnej kolumny chromatograficznej i uwalniać się podczas gradientu fazy ruchomej, powodując pojawianie się dodatkowych pików w chromatogramie. Zjawisko to jest szczególnie widoczne w analizach LC-MS o wysokiej czułości^[9].

Jakie rozpuszczalniki stosuje się w LC-MS – rola acetonitrylu HPLC grade i ultra-czystych reagentów

W analizach spektrometrii mas stosuje się rozpuszczalniki o najwyższej czystości, określane jako rozpuszczalniki LCMS lub MS-Hypergrade. Charakteryzują się one bardzo niską zawartością zanieczyszczeń organicznych oraz minimalną obecnością jonów metali, które mogłyby wpływać na proces jonizacji w źródle spektrometru mas. Do najczęściej stosowanych rozpuszczalników należą woda o bardzo wysokiej czystości, metanol, izopropanol oraz acetonitryl HPLC grade, który jest powszechnie wykorzystywany jako składnik fazy ruchomej w chromatografii cieczowej^[10].

Modyfikatory fazy ruchomej w LC-MS – jak poprawić jonizację i stabilność sygnału

W celu poprawy efektywności jonizacji analitów w spektrometrze mas do fazy ruchomej często dodaje się lotne modyfikatory, takie jak kwas mrówkowy, mrówczan amonu czy octan amonu. Substancje te ułatwiają protonowanie lub deprotonowanie cząsteczek analitów i poprawiają wydajność jonizacji w źródle elektrospray (ESI). Jednocześnie w analizie LC-MS należy unikać stosowania nielotnych buforów, takich jak fosforany czy siarczany, ponieważ mogą one prowadzić do wytrącania się soli w źródle jonów i zanieczyszczenia aparatury. Woda stanowi najczęściej główny składnik fazy ruchomej w chromatografii cieczowej, dlatego jej czystość ma szczególne znaczenie zarówno dla fazy ruchomej HPLC, jak i dla analiz LCMS. W analizach LCMS zaleca się stosowanie wody typu I otrzymywanej w systemach oczyszczania, takich jak Milli-Q, która charakteryzuje się bardzo niską zawartością zanieczyszczeń organicznych i jonowych. Zanieczyszczenia obecne w wodzie mogą prowadzić do wzrostu tła sygnału, powstawania dodatkowych pików chromatograficznych oraz obniżenia czułości metody^[11].

HPLC vs LC/MS – podsumowanie wyboru metody

Można więc uznać, że HPLC pozostaje metodą rutynową w analizach ilościowych, natomiast LC/MS umożliwia identyfikację i oznaczanie związków chemicznych w bardzo złożonych matrycach przy niezwykle niskich stężeniach.

Produkty HPLC i LC-MS dostępne w ofercie sklepu odczynnikichemiczne.com.pl

Zapraszamy do zapoznania się z ofertą odczynników i rozpuszczalników stosowanych w technikach HPLC oraz LC-MS.

Potrzebujesz doradztwa w wyborze odpowiedniego odczynnika chemicznego?

Skontaktuj się z naszym zespołem. Nasi specjaliści z przyjemnością doradzą w wyborze odczynników chemicznych do Państwa potrzeb.

Szukasz dokumentów potwierdzających jakość oraz parametry produktów dostępnych w sklepie odczynnikichemiczne.com.pl?

Zapraszamy do sprawdzenia listy certyfikatów jakości (CoA) do pobrania.

FAQ – HPLC vs LCMS i wymagania jakościowe rozpuszczalników

Bibliografia

1. K. Hiragana, Liquid Chromatography Dynamics: Exploring HPLC, UHPLC and LC-MS for Precision Separation, 2024, s. 1.
2. Ibidem, s.1.
3. E. Caldicot, Advances in High Performance Liquid Chromatography Techniques for Pharmaceutical Analysis, 2024, s. 1.
4. Ibidem, s.2.
5. Ibidem.
6. A. Lazofsky et al., A comparison of four LC–MS platforms for the analysis of zeranols in urine, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2023, s. 4885–4886.
7. S. Altmaier, Sensitivity gains in LC-MS, Focus: Chromatography, 2024, s. 8–9.
8. Ibidem.
9. Ibidem, s.8.
10. Ibidem.
11. Ibidem.